質(zhì)粒提取試劑盒簡(jiǎn)介

質(zhì)粒提取試劑盒簡(jiǎn)介：
質(zhì)粒（Plasmid）是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不
等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞
中。質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制
和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的
遺傳信息。
質(zhì)粒提取原理及流程：
較常用的質(zhì)粒DNA提取方法有3種：堿裂解法、煮沸法和去污劑
（如Triton和SDS）裂解法。前兩種方法比較劇烈，適用于較小的質(zhì)粒
（<15kb）。去污劑裂解法則比較溫和，一般用于分離大質(zhì)粒（>15kb）。
堿裂解法是一種應(yīng)用為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其原理
為：染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分
子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，
線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性
時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞
碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)
存在液相中，離心去除沉淀后，就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。
目前，市面上質(zhì)粒提取試劑盒大多數(shù)都是采取上述的堿裂解方法，
不同之處在于純化方式。目前比較常用的純化系統(tǒng)是硅基質(zhì)吸附材
料，其原理為在高鹽環(huán)境下質(zhì)粒DNA能夠結(jié)合到硅基質(zhì)上，然后用
低鹽緩沖液或水將質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)上洗脫下來(lái)。得到的質(zhì)?？梢?br />用于酶切、PCR、測(cè)序、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
影響質(zhì)粒提取的因素：
質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關(guān)，如宿主菌的種類(lèi)和培養(yǎng)
條件、細(xì)胞的裂解、質(zhì)?？截悢?shù)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素、吸附
柱的吸附量等。
宿主菌種類(lèi)
質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，多數(shù)情況下我們是
從大腸桿菌中提取質(zhì)粒。大腸桿菌的菌株不同會(huì)影響質(zhì)粒提取的
質(zhì)量。從宿主菌如DH5α和*0中可以得到高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。
HBl01和它的衍生菌株，如TG1和JM系列會(huì)在裂解時(shí)產(chǎn)生大量的糖
類(lèi)，如果沒(méi)有*去除，將抑制后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的酶活性，影響質(zhì)粒
DNA提取的質(zhì)量。另外，有些菌株有非常高的內(nèi)切酶活性，會(huì)降低
DNA的得率。因此推薦使用DH5α和*0來(lái)提取質(zhì)粒DNA。
培養(yǎng)時(shí)間
從固體培養(yǎng)基平板上挑取一個(gè)單菌落，接種到培養(yǎng)物中（含有相關(guān)抗生
素的液體培養(yǎng)基中），振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)。不應(yīng)超過(guò)16小時(shí)，因?yàn)檫@時(shí)
細(xì)胞開(kāi)始裂解，使得質(zhì)粒的得率降低，也會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒丟失或質(zhì)粒變異。
質(zhì)粒擴(kuò)增
氯霉素能抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成，但對(duì)松弛型質(zhì)粒的
復(fù)制沒(méi)有影響。因此，在細(xì)菌培養(yǎng)液中加入氯霉素可提高松弛型質(zhì)
粒的拷貝數(shù)。由于氯霉素抑制了宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成，
從而抑制了染色體的復(fù)制，但質(zhì)粒復(fù)制所用的酶半衰期較長(zhǎng)，故質(zhì)
粒仍可繼續(xù)復(fù)制，這樣既可增加質(zhì)粒產(chǎn)量，又可降低細(xì)胞的數(shù)量，
使細(xì)菌裂解液的粘度降低而便于操作。常用于擴(kuò)增的氯霉素濃度為
170ug/ml 。
抗生素
在菌株的各生長(zhǎng)階段都應(yīng)加入抗生素篩選。現(xiàn)在用的許多質(zhì)粒都不
含有在細(xì)胞分裂時(shí)確保平均分配的par位點(diǎn)，無(wú)質(zhì)粒的子細(xì)胞在無(wú)
抗生素時(shí)復(fù)制速度遠(yuǎn)大于含質(zhì)粒的細(xì)胞。

質(zhì)?？截悢?shù):
質(zhì)?？截悢?shù)常用的定義是指生長(zhǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基下每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中
所含有的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目。每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)
粒本身的起始復(fù)制機(jī)制。按照復(fù)制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類(lèi)：一
類(lèi)是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時(shí)，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每
個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有1-2個(gè)質(zhì)粒，如F因子；另一類(lèi)是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染
色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)一般有20個(gè)左右質(zhì)
粒，如ColEl質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬?lài)?yán)緊型，分子量較小的
質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復(fù)制有時(shí)和它們的宿主細(xì)胞有關(guān)，某些質(zhì)粒
在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬?lài)?yán)緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。
部分質(zhì)粒的拷貝數(shù)
質(zhì)粒種類(lèi) 拷貝數(shù) 起始復(fù)制子 類(lèi)型
pUC18/19載體 500-700 pMB1 高拷貝
pBluescript載體 300-500 ColE1 高拷貝
pGEM-T載體 300-400 pMB1 高拷貝
pTZ載體 >1000 pMB1 高拷貝
pBR322載體 15-20 pMB1 低拷貝
pACYC及其衍生載體 10-122 p1 低拷貝
pSC101及其衍生載體 5 pSC101 低拷貝
菌液收集及裂解
細(xì)菌收集可以通過(guò)離心來(lái)進(jìn)行，不同的質(zhì)?？截悢?shù)，菌液量的需
求不同，對(duì)于低拷貝的質(zhì)粒，要相應(yīng)增加菌液的量。菌液是在堿
性環(huán)境下裂解的，由于不同的宿主菌細(xì)胞壁厚薄的差異，細(xì)胞的
破壁程度不同，對(duì)于細(xì)胞壁較厚的宿主菌，首先要進(jìn)行破壁處理：
革蘭氏陰性菌——不用特殊處理，堿裂解時(shí)就能有效破壁
革蘭氏陽(yáng)性菌——溶菌酶處理
酵母和絲狀真菌——酵母破壁酶或玻璃珠
菌液收集、重懸以及宿主菌細(xì)胞破壁后，細(xì)胞在含有RNase A的
NaOH/SDS（溶液Ⅱ）中裂解。SDS溶解細(xì)胞膜的磷脂和蛋白成分，使
細(xì)胞的內(nèi)容物如染色體、質(zhì)粒DNA和蛋白在堿性環(huán)境下變性。佳的
裂解時(shí)間是質(zhì)粒大量釋放而沒(méi)有釋放染色體DNA的時(shí)間，盡量縮短
質(zhì)粒暴露在變性環(huán)境中。長(zhǎng)時(shí)間處在堿性環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒發(fā)生不可
恢復(fù)的變性。變性的質(zhì)粒在瓊脂糖膠上跑的較快，而且不能被限制性
內(nèi)切酶消化。裂解產(chǎn)物在溶液Ⅲ中被調(diào)整到中性高鹽環(huán)境，高鹽使得
變性的蛋白、染色體DNA、細(xì)胞碎片和SDS都沉淀下來(lái)，而質(zhì)粒復(fù)性
留在上清溶液中。溶液要*混勻以確保沉淀*。為了防止染色體
DNA污染質(zhì)粒DNA，要避免劇烈振蕩，以防止染色體DNA被打斷，造
成對(duì)質(zhì)粒DNA的污染。因?yàn)槿旧wDNA的片段和質(zhì)粒DNA在高鹽條件
下，都可以與硅膠膜結(jié)合，在低鹽的條件下，用洗脫液都能從膜上洗
脫下來(lái)。因此，在裂解過(guò)程中要緩慢、輕柔顛倒離心管。
質(zhì)粒DNA分離和純化：
純化要求
質(zhì)粒DNA中不應(yīng)存在對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的酶活性有抑制作用的有機(jī)溶
劑分子或過(guò)高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多
糖、脂類(lèi)、基因組和RNA的污染。不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)于質(zhì)粒純度的
要求不同，常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（如酶切、測(cè)序等）普通純度的質(zhì)粒
即可滿足實(shí)驗(yàn)，而對(duì)于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，要求質(zhì)粒的純度較高（如高純度或無(wú)
內(nèi)毒素）?？梢赃x擇不同的質(zhì)粒提取試劑盒以滿足不同的實(shí)驗(yàn)要求。
純化方法
用硅基質(zhì)材料吸附質(zhì)粒DNA來(lái)代替乙醇沉淀的純化方式，提取的質(zhì)
粒純度高、操作方便快捷，可選擇的試劑盒有兩種類(lèi)型，即普通質(zhì)
粒提取試劑盒和無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒。
質(zhì)粒DNA的洗脫和收集
質(zhì)粒的保存
溶解在洗脫液TE中的質(zhì)粒DNA，也可以貯存在TE緩沖液中（用水溶
解的質(zhì)粒只能短期保存，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室用的純水呈弱酸性，質(zhì)粒在
酸性環(huán)境下會(huì)發(fā)生磷酸解），4℃短期保存或-20℃和-70℃長(zhǎng)期保
存，也可在含有質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物中，加等體積甘油，于-70℃保
存 。
質(zhì)粒鑒定與評(píng)價(jià)：
瓊脂糖電泳檢測(cè)
堿裂解法提取的質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定時(shí)，理想狀況是只出現(xiàn)
超螺旋—條帶，但在質(zhì)粒提取過(guò)程中，由于機(jī)械力、酸堿度、試劑
等原因，使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂，可能出現(xiàn)兩條帶或者出現(xiàn)三條
帶，這三條帶電泳遷移率從快到慢，分別是超螺旋、開(kāi)環(huán)和復(fù)制中
間體（即沒(méi)有復(fù)制*的兩個(gè)質(zhì)粒粘連在—起）。如果加溶液Ⅱ后過(guò)
度振蕩，會(huì)在遠(yuǎn)離這三條帶的位置出現(xiàn)條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，
是大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是，有時(shí)候提取的質(zhì)粒
會(huì)出現(xiàn)4個(gè)以上的條帶，這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度
的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致。但是，只要質(zhì)粒經(jīng)單酶切鑒定
后，只有單一條帶，就證明沒(méi)有基因組的污染。
酶切檢測(cè)
質(zhì)粒提取后，為了進(jìn)—步鑒定質(zhì)粒的正確與否，就要進(jìn)行酶切鑒
定，通過(guò)與Marker對(duì)比，確定質(zhì)粒的分子量大小。
用紫外線分光光度計(jì)檢測(cè)
濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)為：OD260值為1相當(dāng)于大約50ug/ml雙鏈DNA。OD260/
OD280比值在1.7-1.9之間說(shuō)明所得DNA純度較好。OD260/OD280比值
若低于1.7說(shuō)明可能有蛋白污染。OD260/OD280比值若高于2.0則說(shuō)明
DNA有可能已降解。如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子
水，比值會(huì)偏低，因?yàn)閜H值和離子濃度會(huì)影響光吸收值，但并不表
示純度低。